周围神经损伤后慢性失神经及其对神经再生的

周围神经损伤后慢性失神经及其对神经再生的影响

肖霞,丁有权,齐建国

(四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学与神经生物学教研室,成都)

慢性失神经;周围神经再生;施万细胞

人类周围神经损伤后,由于神经再生距离较长、再生速度较慢,长时间后往往在损伤远侧段发生由轴突溃变导致的一系列改变,称之为慢性失神经(chronicdenervation)。慢性失神经不仅涉及远侧段神经,还会影响所支配的肌肉和皮肤以及近侧段神经,导致损伤后神经修复失败,伤者的感觉和运动功能恢复不理想,有的还会出现神经病理性痛。因此,周围神经损伤的研究和治疗不仅要促进轴突再生,还应对慢性失神经问题给以足够的 　　周围神经损伤后神经功能的成功恢复不仅要依赖轴突的再生(包括轴突长度和方向的恢复),还要依赖轴突损伤的神经元的存活、髓鞘的再生、再生轴突与靶器官之间突触的再生、轴突损伤的神经元树突树的重构及其调节、中枢神经环路的重构及其调节等多种因素[1-4]。其中损伤神经元的存活是神经成功再生、恢复对靶器官的功能性支配的首要条件。如果轴突离断的神经元能够存活,那么轴突的及时再生就是周围神经结构和功能完全再生的核心,也是髓鞘再生、再生轴突与靶器官重建突触联系等的基础。如果轴突不能及时再生,迁延时日,损伤的神经将处于慢性失神经状态,功能恢复将十分困难。

　　人类周围神经解剖学位置表浅,容易受到损伤,导致感觉和运动功能的缺失是临床上一种十分常见的神经损伤。传统观念一直认为成年哺乳类动物周围神经的神经元轴突损伤后再生容易,并且能够完全再生。过去20多年的大量周围神经损伤研究也均集中于如何优化外科手术方案,以恢复周围神经的解剖连续性。但是,在临床患者和实验动物模型上均发现,即使经过恰当的外科修复,周围神经受损后感觉和运动功能的恢复仍然非常不理想。其中一个重要原因是周围神经损伤数月或数年后,远侧段神经或靶器官已发生慢性失神经。

　　造成伤者慢性失神经的原因有很多。首先,人类周围神经损伤后再生的时间较长。啮齿类动物轴突再生速度为1~3mm/d,而人类周围神经轴突再生的速度只有1mm/d[5]。即使人类周围神经轴突再生速度与啮齿类动物轴突再生速度相同,人类周围神经损伤后轴突向靶器官及组织再生所需的距离也比啮齿类动物长很多。一个股骨平面的坐骨神经损伤案例提示,人类坐骨神经可能需要超过1年的时间才能使再生的轴突到达mm远的足部,神经远侧段将在很长一段时间内失去神经支配,发生慢性失神经[6]。第二,现有的神经修复技术也会导致慢性失神经的发生。周围神经损伤后,其治疗效果的影响因素有很多,包括修复的方法(神经外膜缝合或神经束膜缝合)和时间(一期修复或二期修复)、是否实施了神经移植及其类型(自体神经移植、异体神经移植或人造神经导管植入)、神经损伤的位置与损伤程度、伤者的年龄等。同时,损伤神经的恢复还与周围神经轴突的再生能力、远侧端神经支持再生的能力、靶组织接受再生轴突的能力有关[1]。例如,人类周围神经横断伤横断处或神经吻合处瘢痕的形成均可导致慢性失神经。

　　此外,除了外科手术修复技术的不足会造成慢性失神经外,由于周围神经损伤在临床上十分常见,延迟修复同样也会导致慢性失神经。外伤、交通事故伤、高空坠落伤等危及生命时,医生要优先处理危及生命的损伤,对存在神经断端不齐、挫伤严重、伤口污染严重的情况可选择延迟修复,漏诊也时有发生。延迟或延误修复使损伤处远侧端神经因长期无神经支配而发生慢性失神经。

　　慢性失神经导致远侧段神经纤维、靶组织、近侧段神经纤维等发生一系列结构和功能上的改变,使周围神经损伤后轴突再生不良,神经功能不能完全恢复。

2.1急性失神经成年哺乳动物周围神经损伤后早期(5周以内),损伤远侧段轴突发生Wallerian变性,施万细胞(Schwanncell)失去与轴突的接触,发生急性失神经。此时,髓鞘化的施万细胞再编程,髓鞘崩解,重新进入细胞周期,施万细胞去分化,大量增殖、迁移,形态上转变成具有长突起的双极细胞,形成Bungner带和施万细胞基板管(Schwannbasallaminatube)(Fig.1A,B)。Bungner带和施万细胞基板管不仅自身产生促进轴突再生的相关分子,还将神经内膜管内抑制轴突再生的分子与再生的轴突分隔开。此时,施万细胞上的髓鞘相关蛋白P0及髓鞘相关糖蛋白(MAG)表达量下降,而生长相关分子表达则上升,包括低亲和性神经生长因子受体(p75)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经细胞粘附分子(L1、N-CAM、N-cadherin)、生长相关蛋白(GAP-43)、神经调节蛋白及其受体(erbB2、erbB3、erbB4)[7]。此外,施万细胞分泌神经营养因子、细胞因子和趋化因子,吞噬轴突和髓鞘崩解的细胞碎片,活化组织性巨噬细胞,招募单核细胞进入损伤远侧端形成巨噬细胞。轴突和髓鞘崩解的细胞碎片具有抑制轴突再生的能力,巨噬细胞大量吞噬轴突和髓鞘崩解的碎片,则促进轴突再生(Fig.1B)。同时,巨噬细胞分泌细胞因子和趋化因子,一方面促进神经元存活和轴突再生,另一方面促进施万细胞的增殖和迁移。

　　急性失神经时施万细胞形成的Bungner带和施万细胞基板管为轴突再生提供物理性和化学性通道,促进神经元存活和轴突再生。急性失神经的施万细胞接触到再生的轴突后会再分化,重建与轴突的相互作用,重新形成髓鞘。因此,急性失神经施万细胞表型的建立和维持一方面促进神经元存活和轴突再生,另一方面为施万细胞相关的结构性再生,如髓鞘再生,提供细胞来源[8]。

2.2慢性失神经成年哺乳动物周围神经损伤后晚期(6至8周左右),如果急性失神经施万细胞没有接触到再生的轴突,施万细胞和轴突长时间失去联系,即发生慢性失神经,损伤处远侧段的微环境将发生改变,最终会变得不再支持轴突再生[4]。在2个月延迟修复后,股神经运动神经元轴突再生的能力降低了近20%[5]。

　　施万细胞长时间失去和轴突的接触后,急性失神经时的细胞增殖和迁移能力下降,神经营养因子及细胞因子分泌减少。在失神经更久之后,施万细胞数量衰减,并失去其反应性表型,细胞开始萎缩、死亡[9]。慢性失神经也会导致施万细胞发生衰老[10]。施万细胞活化状态相关表型的标志分子标记减少,如erB2、erbB4、p75[11];细胞膜表面N-CAM和N-cadherin等粘附分子的表达降低。除此之外,之前形成的Bungner带及施万细胞基板管最终也会消失[12],促进再生能力下降甚至消失(Fig.1C)。

　　神经损伤后,生长因子的表达对神经元的存活和轴突再生都十分重要,但其表达上调是暂时的。失神经48h后神经远侧段施万细胞中胶质细胞源性神经营养因子(glialcellderivedneurotrophicfactor,GDNF)mRNA表达量迅速上调,并在1周时达到顶峰,而在失神经6个月后降至最低水平[13]。神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)mRNA表达量在神经损伤后6h达到顶峰,但这个水平只能维持至2周[14]。也有研究表明NGFmRNA表达量在坐骨神经挤压伤后3d达到顶峰[15]。

　　慢性失神经的施万细胞增殖速率减慢、迁移能力减弱、细胞粘附分子(N-CAM、N-cadherin)表达量减少,并通过GGF/c-erbB通路调节[16]。慢性失神经时间越长,施万细胞中c-erbB表达量越少,支持轴突再生的Bungner带的形成就越少[17]。Bungner带发生萎缩、塌陷,神经内膜管内的一些抑制轴突再生的成分暴露,如硫酸软骨素蛋白多糖(chondroitinsulphateproteoglycans,CSPGs)。这些抑制神经再生的分子与再生轴突接触,进而阻碍甚至停止轴突再生。周围神经损伤后移植神经干细胞表达基质金属蛋白酶2(matrixmetalloprotease-2,MMP-2)或给予软骨素酶治疗,通过降低CSPGs数量的途径可促进神经再生[3,18,19]。

　　除此之外,慢性失神经过程中不同类型细胞的数量也在减少。慢性失神经发生3~6个月,远侧段神经施万细胞数量减少,巨噬细胞数量也在减少,神经内膜和神经外膜的血流量降至未损伤时的水平以下[20,21]。长时间失神经支配,远侧段神经开始萎缩,变成半透明状。由于胶原蛋白沉积,神经出现“纤维化”,神经外膜和神经束膜内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA大量表达。神经外膜的成纤维细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白mRNA的表达可促进周围神经横断伤处疤痕的形成,进而阻碍周围神经的结构和功能的恢复[20]。

3.1肌改变去神经支配的肌肉会发生很多实质性的改变,包括肌萎缩、肌纤维的数量改变、肌细胞膜电性能改变、乙酰胆碱敏感性和兴奋收缩偶联过程改变、肌颤动等。慢性失神经6个月后,肌重量和肌强度降至原有水平的30%[22]。随着失神经时间的延长,肌出现明显的萎缩,肌纤维数量减少、直径变小(Fig.1C)。长期失神经支配的肌还会出现空泡变性、玻璃样变性、肌纤维逐步解体等形态变化,肌肖霞:周围神经损伤后慢性失神经及其对神经再生的影响总重量减少。在失神经过程中,肌细胞的超微结构也会发生变化,包括肌原纤维瓦解和结构破坏、核糖体数量变化、线粒体数量和大小的改变以及肌浆网形态的改变。肌浆网改变包括终池肥大、横小管增生、三联体数目增多,这些变化会改变兴奋收缩耦联过程,也是失神经后肌收缩发生改变的原因。肌萎缩不会阻碍神经再生,但在人类,长时间(10~20年或更久)失神经支配肌肉的肌电图中可见电信号沉默,并伴随肌的“木质化”或纤维化,此时恢复神经支配几乎是不可能的。

　　神经纤维终末的施万细胞的表现对促进神经再支配十分重要。终末施万细胞引导轴突再生进入失神经支配的终板,它们的缺失将导致轴突沿原路径再生的失败。终末施万细胞的可塑性可能会随着失神经时间的延长而逐渐减弱,终板可能因此而缺失。运动神经元轴突不能再生至终板缺失的位置,导致神经再支配失败[24]。

3.2皮肤改变慢性失神经过程中,失神经支配的皮肤及其他器官也会发生改变。在慢性多发性神经性病变患者身上可观察到皮肤萎缩、毛发脱落等现象,这些变化可能与感觉丧失的程度密切相关。失神经支配的皮肤也容易出现破裂和溃疡。其原因可能与失神经支配的皮肤无法识别损伤、分泌汗液的汗腺失去交感神经支配有关。正常的出汗可滋润和保护皮肤,失去汗液分泌的皮肤会变厚、破裂、易受伤害和感染。

　　感觉神经可以在皮肤和其他器官释放神经肽,影响其微循环和伤口愈合,P物质(SubstanceP,SP)和降钙素基因相关肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)就是其释放的两种主要神经肽。感觉神经末梢参与它所支配组织的炎症反应,导致神经源性炎症。当组织去神经支配后,其神经源性炎症的反应显著减弱。由于炎症反应对伤口愈合很重要,因此去神经支配的皮肤和其他组织的修复能力受损,包括伤口边缘闭合延迟、微血管反应减弱、炎症阶段延迟和延长、增生性瘢痕产生延迟、上皮细胞迁移延迟[25]。SP有助于血浆外渗和血管舒张,CGRP具有强大的血管扩张作用[26]。去神经支配的皮肤中由于“肽能”感觉神经元轴突的缺失,伤口愈合所需的神经肽缺失,导致皮肤的修复能力受损。皮肤或肌肉的神经支配出现永久性中断时,侧枝出芽是皮肤或肌恢复神经支配的重要机制。伤害性感觉神经轴突存在活跃的侧枝出芽,而在传递触压觉的粗直径感觉神经轴突中却没有观察到这种现象。与背侧躯干皮肤相比,后肢的皮肤轴突侧枝出芽较少。如果损伤部位的相邻区域内完好的神经元的数量较少,则侧支出芽的可能性将会降低[27]。

　　如果周围神经发生慢性损伤且不能再生,损伤神经的近侧段也会发生一系列变化。随着损伤时间的延长,神经元逐渐退化并缺失(Fig.1C)。例如,神经长时间切断后,运动神经元的数量减少60%[9],这些结果会降低轴突出芽至远侧段神经的可能性。此外,神经长时间切断后近侧段神经元的轴突不会再表现出强大的生长能力。幸运的是,侧枝出芽可以在一定程度上弥补不可逆的神经元损失导致的功能障碍。Lago和Navarro报道了一个令人兴奋的现象,他们发现在模拟截肢的大鼠模型中,损伤的近侧段神经残端中神经元轴突可以在较长一段时间内保持它们的出芽数量。当轴突不能再生至靶组织时,轴突过多的侧枝出芽将形成神经瘤。即使长达9个月后,这些再生轴突依然维持其免疫组织化学标志物的表达,如ChAT、CGRP、GAP43/B50。这些结果提示,长期横断的神经依然保留与远侧段目标重新连接的能力。截肢后可能会出现这种情况,作者认为这些完好的近侧段轴突可能是连接假肢的潜在位点[28]。

　　虽然在没有与靶器官重新连接的近侧段神经中存在一些轴突,但Furey等人在长期损伤的情况下,观察到运动神经元不易长出新的轴突以支持再生。他们设计的实验将大鼠股神经横断造成慢性损伤,并将横断的股神经近侧段与一段盲管缝合以阻止其再生,或将其与没有支配肌肉的隐神经缝合。两个月后再次将股神经横断,然后将其近侧段与新鲜横断的隐神经远侧端缝合,并在之后检测其运动神经元的再生能力。结果表明在相同时间段内,与急性损伤的运动神经元相比,慢性损伤的运动神经元轴突再生重新形成神经-肌连接的能力较弱。这表明慢性损伤对运动神经元的再生能力具有长期的负面影响,使其再生能力减弱[29]。

　　总之,神经与靶组织长时间断开连接是一种常见、但对再生十分不利的临床情况。在此期间,母神经元可能会对再生刺激无法做出回应。虽然这些神经元可能会发出多个子芽,其与靶组织重新连接后将有部分功能恢复,但这并不能补偿母神经元无法对再生刺激做出回应所带来的功能上的缺失。

　　周围神经损伤后外科修复通常会被延迟,即使是损伤后立即修复,神经也要再生很长一段距离至目标组织,导致修复后效果不理想,因此寻找改善神经再生的方法尤为重要。过去20年里,人们对短暂电刺激损伤神经近侧段促进功能恢复做了广泛研究[30]。短暂低频电刺激(1h,20Hz)后,运动神经元轴突进入修复位点的数量增加,运动神经元的再生能力提高。此外,电刺激还可以提高感觉神经元的再生能力。最新研究表明,在慢性失神经环境中,电刺激也可以提高神经元的再生能力。即使是在延迟手术修复受伤神经的动物模型和伤者身上,短暂的电刺激也可以加快运动神经元和感觉神经元轴突生长至损伤部位,促进神经再生并与靶组织恢复神经支配。电刺激使神经元环磷酸腺苷表达增加,反过来促进神经营养因子和其他生长相关基因的表达,包括BDNF、NT-4/5、trkB、细胞骨架蛋白等,这可能是电刺激促进神经再生的分子机制之一[31]。Gordon等人[32]证明通过神经交叉桥连(cross-bridges)技术也可以提高延迟修复的神经的再生能力。他们将大鼠慢性损伤的腓总神经( 　　周围神经损伤后,远侧段神经施万细胞分泌的神经营养因子,如GDNF、BDNF,对神经元轴突再生十分重要。但随着失神经时间延长,内源性的GDNF、BDNF数量减少,轴突再生能力减弱。Boyd等[34]的研究证明,长期持续性给予外源性GDNF治疗可以明显增加运动神经元的数量,促进其轴突再生,可逆转慢性损伤带来的不良影响。他们还观察到不论是单独给予GDNF治疗,还是GDNF和BDNF联合治疗都可以增加运动神经元的数量,增加轴突出芽到损伤远侧段神经的数量。在腓总神经横断伤的慢性失神经模型中,在神经缝合处建立一个药物传递系统,给予含有GDNF微球的纤维蛋白凝胶。结果发现给予GDNF治疗后,延迟修复的神经中运动神经元轴突再生的数量与及时修复的神经中运动神经元轴突再生的数量相当[35]。而在大鼠同种异体神经移植(A-cellularnerveallografts,ANAs)模型中也得到相同的结果:含有GDNF微球的纤维蛋白凝胶持续性释放GDNF给移植的ANAs,使其运动神经元和感觉神经元轴突再生的数量明显增加,促进其神经再生[36]。这些研究表明,长期持续性给予外源性神经营养因子可以作为维持神经元轴突再生能力、促进神经再生的一种可行的治疗方案。

　　移植神经干细胞也是一种促进神经再生的方法。在SD大鼠中,将大鼠左侧胫神经横断制造慢性失神经模型。6个月后给胫神经损伤远侧段注射C17.2小鼠神经干细胞,并将新横断的腓神经近侧段与胫神经慢性失神经远侧段缝合。结果表明,在胫神经支配的足底肌内检测到复合动作电位,腓神经的神经元轴突再生至胫神经损伤远侧段的能力得到提高,细胞外基质的CSPGs免疫反应性降低。此外,还可以使C17.2小鼠神经干细胞在损伤神经远侧段过表达GDNF。结合神经营养因子的支持,并移除细胞外基质中抑制轴突生长的成分,可以达到促进周围神经再生的目的[3]。这些结果有望应用于临床治疗慢性失神经。

　　长期以来,周围神经损伤后的再生修复并不像中枢神经系统损伤那样受到人们的重视。但是,随着人们对生活质量要求的不断提高,周围神经损伤后修复与功能恢复已慢慢受到人们的重视。本文从慢性失神经的概念入手,阐述了周围神经损伤慢性失神经后近侧段神经、远侧段神经、失神经支配的靶器官的改变及其对神经再生的影响,并列举了一些促进神经再生的方法,希望为周围神经损伤延迟修复与再生的临床治疗提供新思路。

　　目前,慢性失神经的研究主要集中在慢性失神经发生后施万细胞的表现、轴突再生的变化、促进神经再生等方面,而在周围神经损伤后延迟修复与神经病理性疼痛的关系的研究却鲜有报道。事实上,综合临床实践和动物实验数据可知,周围神经损伤后经过合适的临床治疗后再生神经再支配的皮肤区域会出现持续的、难治的机械性疼痛异常等神经病理性痛的症状,而慢性失神经在此过程中所扮演的角色尚不知晓。因此,在今后的研究过程中,需要对周围神经损伤修复后慢性失神经是否参与神经病理性痛的发生及其分子机制进行深入的研究。

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